Анализ состояния здоровья новорожденных свидетельствует о неуклонном росте инфекционной заболеваемости, которая у недоношенных детей в 4,5 раза выше, чем у доношенных, и составляет около 780 на 1000 недоношенных, родившихся живыми [1–3].
Инфекционно–воспалительные заболевания являются ведущей причиной смертности маловесных новорожденных и занимают второе место после гипоксии и асфиксии в родах [4]. Иммунная система, наряду с ЦНС и эндокринной системой, участвует в поддержании гомеостаза организма ребенка и установлении оптимального баланса во взаимоотношениях с окружающей средой.
Считают, что в основе развития инфекционных заболеваний лежит относительная незрелость иммунной системы недоношенного ребенка. Это касается системного (гуморального и клеточного) и местного иммунитета [1,5–9]. Основной формой иммунологического ответа на введение генетически чужеродных веществ и инфекцию является образование неспецифических факторов защиты. Гуморальные факторы защиты недоношенного ребенка в основном представлены материнскими антителами, однако наибольшее поступление иммуноглобулина G (IgG) через плаценту происходит после 34 нед. гестации. Иммуноглобулины классов А и М в организме недоношенного практически отсутствуют [1,10].
У новорожденных в качестве противоинфекционной защиты возрастает роль фило– и онтогенетически более ранних неспецифических факторов защиты, в первую очередь системы интерферона, который играет важную роль в формировании иммунитета [11,12]. Степень зрелости морфологического субстрата иммунной системы недоношенных детей к моменту рождения зависит от гестационного возраста ребенка, антигенной нагрузки, патологических воздействий, которым подвергается плод при осложненном течении беременности и нарушении иммунологической взаимосвязи в системе мать – плод – новорожденный [13–15].
В ряде работ [16,17] доказана взаимосвязь инфекционной патологии матери, осложненного течения родов, развития ишемии–реперфузии в различных органах и тканях с противоинфекционной резистентностью ребенка. Считают, что в основе нарушений  формирования и созревания иммунной системы плода лежит ее угнетение вследствие избыточной антигенной стимуляции в ответ на инфекционные факторы и другие чужеродные антигены, поступающие от матери. В связи с этим изучение особенностей формирования иммунной системы плода в зависимости от характера течения гестационного периода имеет большое практическое и теоретическое значение. Наибольший практический интерес представляют анализ взаимосвязи гестационного возраста, внутриутробной инфекции, патологии фетоплацентарного комплекса, уровней иммуноглобулинов и гамма–интерферона как показателей, отражающих уровень противоинфекционной резистентности недоношенного ребенка, и оценка целесообразности применения иммунотропных средств для лечения этой категории пациентов.
Цель: дать характеристику гуморального иммунного ответа недоношенных новорожденных с очень низкой (ОНМТ) и экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) в зависимости от действия анте– и постнатальных факторов риска и оценить эффективность иммуномодулирующей терапии в комплексном лечении.
Материалы и методы
Всего обследовано 65 недоношенных новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ при рождении. В качестве иммуномодулирующего препарата был выбран Кипферон® суппозитории для вагинального или ректального введения (Кипферон®). Из общего числа включенных в исследование детей сформировано три группы. В 1–ю группу вошло 25 детей. Кипферон® применяли с первых суток жизни по ½ cуппозитория 1 раз/сут. (250000 МЕ в перерасчете на ИФН) в течение 14 дней. Во 2–ю – 20 человек (Кипферон® назначали в той же дозе после первого курса антибактериальной терапии или при клиническом ухудшении, обусловленном нозокомиальной инфекцией), 3–ю группу (группу сравнения) составили 20 недоношенных новорожденных (получали стандартную комплексную терапию без иммуномодуляторов).
Новорожденные дети в сформированных группах были сопоставимы по гестационному возрасту, массе тела при рождении и существенно не различались по данным антенатального анамнеза и состоянию при рождении. Все дети с рождения находились в условиях неонатальной реанимации, с первых суток жизни получали инфузионную, антибактериальную терапию и энтеральное питание, которое в течение первых 2–3 сут. жизни в связи с тяжестью состояния было представлено адаптированной молочной смесью для недоношенных детей. Всем детям проводился стандартный объем лабораторных и инструментальных исследований согласно протоколу ведения и выхаживания недоношенных новорожденных в условиях перинатального центра.
Кровь для исследований брали на третьи и двадцатые сутки жизни, у детей 2–й группы – на третьи и тридцатые. Биологическим субстратом для исследования являлись сыворотка крови и копрофильтраты. Сыворотку получали путем центрифугирования цельной крови при 3000 оборотах в течение 15 мин. Для получения копрофильтратов 1 г свежих фекалий смешивали с 1 мл физиологического раствора. Взвесь центрифугировали при 3000 оборотах в течение 15 мин. Образцы надосадочной жидкости сразу после получения замораживались и хранились при температуре –20°С, до исследования иммуноглобулинов (Ig). Cывороточные (IgG, IgA, IgM) и секреторные иммуноглобулины (IgG, IgA, IgM, sIgA) определяли методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини (1965). Гамма–интерферон в сыворотке крови и копрофильтратах определяли методом трехфазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест–систем (ООО «Цитокин», Санкт–Петербург) с учетом рекомендаций производителя.
Цифровой материал обрабатывался стандартными методами вариационной статистики с использованием программы Statistica v. 7.0 (StatSoft, США, 2001). Опре­де­ляли средние величины исследуемых показателей (М), стандартную ошибку средних (m), уровни статистической значимости (р) различий между значениями показателей в разных группах оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали значимыми при p<0,05; p<0,01.
Результаты и обсуждение
При анализе анамнестических данных установлено, что абсолютное большинство матерей имели высокий уровень общей экстрагенитальной (84%) и урогенитальной (76,4%) патологии. В структуре экстрагенитальной патологии преобладали сочетание инфекционно–соматической патологии (47,6%) и изолированная патология сердечно–сосудистой системы (38,3%). Среди урогенитальной патологии чаще регистрировалась хроническая воспалительная патология: эрозии, аднексит, сальпингоофорит, кольпит.
Во всех случаях отмечалось осложненное течение беременности. Патология II и III триместров во всех группах диагностирована у более чем 90% женщин, нередко в сочетании с обострением инфекционного процесса (35%). По мере прогрессирования беременности возрастал удельный вес патологии за счет тяжелых форм гестоза, фетоплацентарной недостаточности (ФПН), задержки развития плода (70,7%). У более чем 40% беременных женщин преждевременные роды связаны с нарастанием тяжести гестоза и декомпенсацией ФПН.
По результатам исследования сыворотки крови, взятой на 3–4 сут. жизни, IgA определялся у 10 детей (15,4%) в средней концентрации 0,08±0,02 г/л (при норме в пуповинной крови 0,03 г/л). Из 10 детей у двух IgA определялся в концентрации 0,02 г/л. Эти дети имели срок гестации 32 нед., что соответствует данным литературы о том, что синтез IgA плодом в следовых количествах возможен в норме с 30–й нед. гестации, а при антигенной стимуляции инфекционными агентами – начиная с 13–14–й нед. внутриутробного развития [18,19].
IgA у детей с ЭНМТ и сроком гестации менее 30 нед. не определялся. Выявлено отрицательное влияние на синтез IgA длительного безводного периода (0,13±0,04 г/л), инфекций, передающихся половым путем (ИППП), выявленных во время беременности (0,13±0,04 г/л). Кроме того, IgA в сыворотке крови чаще определялся у детей, которые впоследствии реализовали внутриутробную инфекцию (ВУИ). Сопоставляемые показатели по сравнению с детьми без реализации инфекции составили соответственно 30 и 15%.
IgM определялся в сыворотке крови у всех детей в средней концентрации 0,22±0,03 г/л. У 6 детей уровень сывороточного IgM был выше 0,4 г/л, а у 4 детей – выше 1,0 г/л. Матери детей с концентрацией IgM >1,0 г/л имели в анамнезе воспалительное заболевание урогенитального тракта в последнем триместре беременности. Обращает на себя внимание тот факт, что высокий уровень IgM коррелирует с высоким уровнем IgA в сыворотке крови и длительным безводным периодом, что косвенно подтверждает роль инфекционного фактора. Само­стоя­тельный синтез плодом IgM начинается с 12–15–й нед. внутриутробного развития, а к моменту рождения его содержание составляет 5–20% величины взрослого. Иммунная система плода при его контакте с чужеродными антигенами реагирует увеличением синтеза IgM. По данным Д.В. Стефании, Ю.В. Вельтищева,  повышение концентрации IgM при рождении более 200–300 мг/л свидетельствует об антигенной стимуляции плода или о его внутриутробном инфицировании, что соответствует результатам нашего исследования.
IgG в сыворотке крови определялся у всех детей в средней концентрации 4,132±0,2 г/л. Отмечена взаимосвязь уровня IgG с гестационным возрастом, массой тела при рождении (4,55±0,3 г/л у детей с ОНМТ и 2,857±0,2 г/л у детей с ЭНМТ; p<0,01) и наличием острого инфекционного процесса во время беременности (3,46±0,3 г/л в сравнении с 4,49±0,2 г/л; p<0,05), у детей без обострения инфекции во время течения гестационного процесса.
К концу 1–го месяца жизни во всех группах детей отмечено увеличение частоты встречаемости и уровня сывороточного IgA и IgM в среднем в 1,5–2 раза. Во 2–й группе (Кипферон® применяли после развития госпитального инфекционного процесса) сывороточный IgA выявляли в 2 раза чаще (66,7%), чем в 1–й (31,2%) и контрольной (33,3%) группах (p<0,05). IgM достоверно чаще выявляли у заболевших детей (p<0,05). У всех недоношенных детей к концу неонатального периода в сыворотке крови снижался IgG без значимой разницы в группах.
Секреторный иммуноглобулин А (sIgA) в копрофильтратах определялся у 5 детей на третьи сутки жизни в следовых концентрациях, сывороточный IgA – у 11 детей, причем у 10 детей из 11 развился впоследствии острый инфекционный процесс. Выявлена значимая взаимосвязь уровня IgA в копрофильтратах с инфекционным процессом (0,06±0,01 г/л) и обострением ИППП во время беременности (0,04±0,01 г/л).
IgG в копрофильтратах глубоко недоношенных детей выявлены у 49 детей (75%). Установлена зависимость концентрации IgG от гестационного возраста и массы тела при рождении (0,15±0,03 г/л у детей с ЭНМТ и сроком гестации менее 30 нед. и 0,07±0,01 г/л у детей с ОНМТ и сроком гестации более 30 нед.), наличия острого инфекционного процесса, обострения ИППП во время беременности и уровня IgG в сыворотке крови.
На 20–30 сут. жизни отмечено нарастание частоты выявления sIgA в копрофильтратах в среднем в 4–5 раз у всех детей. При этом у детей, получавших Кипферон®, выявлено также увеличение уровня sIgA – в среднем в 2 раза в 1–й группе (с 0,02 до 0,04 г/л) и во 2–й (с 0,04 до 0,13 г/л; p<0,05).
IgA не определялся у детей, получавших Кипферон® с первых суток жизни и у которых не развился постнатальный инфекционный процесс к концу неонатального периода. Во 2–й группе с развитием инфекционного процесса отмечено снижение уровня с 0,03 до 0,015 г/л и выявления IgA с 35 до 26,7%; p<0,05. У детей 1–й и 2–й групп также выявлено достоверное снижение концентрации и частоты выявления IgG в копрофильтратах. В то же время у детей группы сравнения, не получавших Кипферон®, к концу 1–го месяца жизни выявлены увеличение частоты встречаемости IgA с 10 до 50% и повышение уровня IgG в копрофильтратах (рис. 1).
Интерферон–гамма (ИФН–γ) в сыворотке крови на 3 сут. жизни определялся у всех новорожденных с ОНМТ и ЭНМТ в средней концентрации 86,5 пкг/мл, что в 2,5 раза превышает аналогичный показатель у здоровых доношенных новорожденных. По данным литературы известно, что наличие у матерей в период беременности и родов острых или обострения хронических воспалительных заболеваний сопровождается у здоровых недоношенных детей существенным увеличением (до 6 раз) способности лимфоцитов к продукции гамма–интерферона. Это является отражением внутриутробной антигенной стимуляции под влиянием неблагоприятных факторов, воздействующих на плод, и указывает на достаточно высокие компенсаторные возможности иммунной защиты у этих детей [Малиновская В.В., Ке­шишь­ян Е.С., 2006]. Выявлена зависимость уровня ИФН–γ от наличия острого инфекционного процесса во время беременности, выявленных ИППП, длительного безводного периода (рис. 2).
Известна зависимость показателей системы интерферона от степени тяжести инфекционного процесса. По результатам исследования выявлена тенденция к угнетению интерфероногенеза при развитии внутриутробных и нозокомиальных инфекционных заболеваний. Так, отмечено снижение уровня гамма–интерферона к 20 сут. жизни в контрольной группе с 83,2 до 33,2 пкг/мл. Однако в группе детей, получавших Кипферон® на 7–10 сут. жизни, ИФН–γ оставался на высоком уровне – 71,4 пкг/мл. У детей 1–й группы, в которой Кипферон® назначался с профилактической целью, с первых суток жизни отмечалось нарастание уровня ИФН–γ – с 17,4 до 24,4 пкг/мл. Такая динамика рассматривалась нами как положительный ответ иммунной системы на препарат. Гамма–интерферон в копрофильтратах на 3 сут. жизни определился у 3 детей, средний показатель – 31,9±7,8. Все эти дети родились у матерей с тяжелым гестозом, ФПН и обострением урогенитальной инфекции во время настоящей беременности. Дети к моменту забора анализов находились в очень тяжелом состоянии. Можно предположить, что данный факт является отражением стимуляции интерфероногенеза плодом в ответ на внутриутробную инфекцию и неблагоприятные факторы беременности. На 20–30 сут. жизни гамма–интерферон в копрофильтратах не выявлен ни у одного ребенка.